プラスミドエディターApEによるMultiple Alignment

研究
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こんにちは。JON@u_rigakubuです。
閲覧ありがとうございます!

今日は、実験のマニュアルを書きます。こんな記事も増やしていければと思っています。第1回は、プラスミド作成時などに使える、シーケンスのアラインメントについてです。

無料の万能プラスミドエディターApE

詳細は省きますが、以下の特徴があります。有料のソフトもありますが、同じようなことはだいたいApEでできます。1おすすすめです。

  • DNA配列(fasta, genebankなど)を読み込むことができる
  • 波形データ(.ab)も読める
  • プラスミド地図を自動で作成できる
  • 制限酵素サイトを検索できる
  • シーケンスのアラインメントができる
  • 無料
  • Mac, Windows両方使える

機能の詳細についてはこちら。
公式HPの日本語訳(非公式):tps://life-science-project.com/540/


ダウンロードはこちら。
公式HP:http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/

Multiple Alignmentの必要性

今回のメインは、Multiple Alignmentの使い方についてです。とても便利なのですが、どうも日本語の記事が無いようなので、紹介します!


シーケンスをすると、数百bp程のfasta形式の配列と、ab形式の波形データが手に入ると思います。これを簡単に元のテンプレートと比較して、どの配列に変異があるのか?そして対応する波形はきれいか?を見ることができます。


特に最近では、in-fusion cloningあるいは、 iVEC3 (in vivo E. coli cloning) 2 と言った技術の台頭で、「PCRによりプラスミド全体を増幅する」と言った機会も増えてきています。よって、コード領域全長のシーケンスを読まないといけないという状況も増えていると思います。3

Apeを使えば、複数ファイルに渡る数kbのシーケンス結果を一括で見比べることができますよ!配列データを1つずつ手で開いたり、波形データと睨めっこしたりと言った煩わしい作業からは解放されます。

Multiple Alignmentの使い方

  1. 読んだab形式のファイルを全部開く4
  2. 完成予想の配列のファイルを開く
  3. 下の一番右のボタンを押す(Tools < Align Sequences… でも可)
メニューバーの右端にAlign Sequencesは存在する
Align Sequencesを選択すると、ウィンドウがポップアップする
  1. 重要 Directionカラムで、ForwardかReverseを選択する。デフォルトでBestとなっているところをクリックすれば変更できます。5
  2. Reference Sequenceに完成予定の配列のファイルを指定
  3. abファイルをドラッグして選択。
  4. OK(パラメータを変えられるようですが、デフォルトで良いです。)

これで、以下のように結果ウィンドウが表示されます。

アラインメントの結果例

1番上の行が完成予定の配列(今回はplasmid.ape)で、2番目、3番目と読んだシーケンスの配列がアラインされます。

今回の例だと、重複して同じ領域を読めているので、2・3番目に同じ配列が出ていますね。


変異が入っていると、赤で教えてくれます。今回だと、GがCに変異しているようです。

そこで、シーケンスの読み間違いかみたいと思うので、Cの部分にカーソルを重ねます。すると、このように波形が見れるのです。(拍手!)

カーソルを重ねることで波形が読める

さらに、テンプレートの配列をダブルクリックすると、元のファイルで該当する塩基まで飛ぶことができます。(便利!)

これで何kbであろうと、一発でシーケンスが読めているかどうかを確認することができました!

まとめ

いかがでしたか?今回紹介した方法でシーケンス解析をタダで、楽にすることができ、少しでもあなたの研究が捗れば幸いです。

マーカーの設定がまだの方は是非こちらの記事を参考に設定してください。捗りますよ!


Apeを使ったことが無いけど興味がある!という方は、以下も参考になりますよ。

統合TV:https://togotv.dbcls.jp/20130527.html

  1. ヒトゲノム計画でプロジェクトの一環で開発されたそうな。
  2. iVECが流行ったら、in fusionは廃れるのでは無いかと思いますが、まだあまり気付かれていないんでしょうか?
  3. 適当なラボだと、シーケンス読まない!ってところもあるらしいですが。。いくら正確性の高いポリメラーゼを使っているからと言って、それはやめましょうね。
  4. 配列をみなくていいなら、fastaでもOKです。
  5. Bestにしたら自動で決めてくれて便利なのですが、うまくいかないことが多いです。

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